基因工程(DNA重组技术)是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”,并按照人们的意愿重新组合,以改变生物的性状和功能,然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内,并使其在生物体内或细胞中表达,从而获得新的生物机能。这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。

自1983年首次获得转基因植物以来,便深受育种工作者青睐,得到了蓬勃地发展。至今已有30多科约200多种植物转基因成功;国际上相继有30多个国家批准3000多例转基因植物进入田间试验,并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产。通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。转基因的方法很多,最常用的有农杆菌介导的遗传转化法和基因枪转化法。无论哪种方法,转化细胞与非转化细胞相比都只占少数,两者存在竞争,而作为异种细胞的转化细胞的竞争力很弱。因此,必须对转化细胞进行筛选。在有选择压力的条件下,利用抗性基因在转化体内的表达,有利于从大量的非转化细胞中选择出转化克隆。目前使用的选择性试剂主要有抗生素类、除草剂类、氨甲喋呤、氨基酸类。

1.?????? 抗生素抗性基因:

npt, 新霉素磷酸转移酶基因,对卡那霉素, G418, 巴龙霉素及新霉素等具有抗性;aphIV, 潮霉素磷酸转移酶基因,对潮霉素具有抗性;spt, 链霉素磷酸转移酶基因,对链霉素具有抗性;cat, 氯霉素乙酰转移酶基因,使氯霉素丧失抗菌素活性;Aacc3和aacc4, 庆大霉素3-N-乙酰转移酶基因,对庆大霉素有抗性;ble, 博来霉素抗性基因,对博来霉素有抗性。

2.?????? 抗除草剂抗性基因bar, 编码膦化麦黄酮乙酰转移酶(PAT),使PPT(膦化麦黄酮)的自由氨基乙酰化而对PPT中毒。抗除草剂草丁膦和双丙氨膦;epsps, 草甘膦抗性标记基因,抗草甘膦;als,绿黄隆抗性标记基因。威尼德生物科技(北京)有限公司(www.bio-vleader.com),研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用,瞬时提高细胞膜的通透性,从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法,是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。

3.?????? 显色或发光报告基因(1)GUS酶活性检测GUS使β-葡萄糖苷酶,能催化裂解一系列的葡萄糖苷,产生一系列具有发色基团或发荧光的物质,可用分光光度计、荧光计或组织化学法对GUS活性进行定量和空间定位分析,检测方法简单灵敏。(2)荧光素酶活性检测荧光素酶催化的底物使6-羟基喹啉类似物,在镁离子、ATP及氧的作用下酶使底物脱羧,生成激活态的氧化荧光素,发射光子后,转变成常态的氧化荧光素。(3)绿色荧光蛋白检测GFP产生绿色荧光蛋白,在395nm和490nm的波长下发出独特的绿色荧光。传统的筛选方法是利用抗生素和除草剂类选择剂,但这些物质对人类和环境的影响还不完全了解,因此,非抗生素筛选系统应运而生。

甘露糖阳性选择系统属于非抗生素筛选系统之一,其原理是:甘露糖不能维持各种外植体的生长。当培养植物细胞添加甘露糖时,它只被转化为6-磷酸甘露糖,不能进一步参与代谢,而积累至毒性水平。科学家克隆编码6-磷酸甘露糖异构酶的基因作选择基因,构建表达载体遗传转化植物,用甘露糖作选择剂,选择基因编码的6-磷酸甘露糖异构酶则可将6-磷酸甘露糖转化为易于糖酵解的6-磷酸果糖。威尼德生物科技(北京)有限公司(www.bio-vleader.com),研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用,瞬时提高细胞膜的通透性,从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法,是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。和传统的遗传转化方法相比,包含甘露糖选择在内的新筛选方法有利于转基因组织的再生和生长,同时使非转基因组织因饥饿而死,而不是杀死它们,称之为正向选择法;传统的抗生素选择法或除草剂选择法将未转化细胞杀死则被叫做负向选择法。

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