电穿孔是将受控直流(DC)电脉冲应用于活细胞和组织的短时间。脉冲诱导跨膜电位,从而导致细胞膜可逆性破裂。这种作用导致细胞膜的渗透或“孔隙形成”,从而允许引入小分子(如染料、寡核苷酸或肽)和大分子(如蛋白质、DNA和RNA)进受体。在这个过程中,细胞对分子的吸收持续到气孔闭合,这可能需要几毫秒到几分钟。电穿孔过程的优化涉及多个因素。选择波形、确定场强和调整脉冲长度只是几个关键变量。在优化中起关键作用的其他参数包括细胞直径、质粒浓度、温度和电穿孔缓冲液。

波形

脉冲形状通常分为两类,方波或指数衰减波:

方波脉冲

方波脉冲快速上升到设定的电压水平,在设定脉冲长度的持续时间内保持该水平,并快速关闭。方波在哺乳动物细胞中产生更高的效率和可行性。与指数衰减波相比,方波电穿孔在体内和体外组织、胚胎和植物原生质体应用中产生更好的结果。

指数衰减波脉冲

指数衰减波通过允许电容器完全放电产生电脉冲。当脉冲放电时在样本中。电压迅速上升到设定的峰值电压,然后随时间下降。强大的指数衰减波脉冲通常用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、酵母、植物组织、昆虫细胞和一些哺乳动物细胞的转化。威尼德生物科技(北京)有限公司(www.bio-vleader.com),研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用,瞬时提高细胞膜的通透性,从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法,是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。

场强

场强测量为穿过电极间隙的电压,表示为kV/cm。场强对于超过细胞膜的电势以允许临时可逆渗透或“孔隙形成”至关重要

发生在细胞膜上。优化场强应考虑三个因素:

1.电极间隙尺寸

2.细胞直径

3.温度

电池类型场强范围

细菌/酵母:3-24千伏/厘米

哺乳动物:0.25–3千伏/厘米

大肠杆菌:3-12千伏/厘米

电极杯直径

在优化电穿孔实验时,电极之间的距离或“间隙大小”非常重要。使用电压除以间隙大小计算场强。例如,使用具有500 V电压的4 mm间隙反应杯将提供1.25千伏/厘米。如果使用2mm间隙反应杯代替4mm间隙反应杯,则必须将电压降低一半或250 V,以保持1.25 kV/cm的相同场强。如果所需的场强和电场强度满足要求,则可以导出完成电穿孔所需的电压间隙大小是已知的。计算方法是磁场强度(kV)乘以间隙尺寸(cm)等于电压。例如,如果用户确定某个区域需要1.25 kV/cm的场强1 mm间隙反应杯-计算结果为:1.25千伏x 0.1厘米=0.125 kV或125 V。

例子:电场强度为1.25 kV/cm 4 mm间隙反应杯=500 V

2毫米间隙反应杯=250伏1毫米间隙反应杯=12伏

细胞直径

通常,较小的电池尺寸需要较高的电压,而较大的电池直径需要较低的电压才能成功渗透细胞膜。

温度

细胞在电穿孔过程中保持的温度影响电穿孔的效率有几个原因。大多数哺乳动物细胞系是在室温下有效电穿孔。在高压下脉冲或暴露于多个脉冲和长脉冲持续时间下的样品可导致样品加热。这些条件导致细胞死亡增加,并降低转染效率。将样品保持在较低的温度可以减少加热对细胞活力和效率的影响。由于电穿孔会导致气孔的瞬时形成,因此在脉冲后将细胞保持在较低的温度可能会使气孔保持更长的开放时间,以便更多地吸收外源分子。但其他电池的温度较低细胞系可能具有破坏性,并导致高细胞死亡率。这种效应是每个细胞系特有的,在优化研究期间应予以考虑。室温下用于细胞的标准脉冲电压需要在4°C下电穿孔时大约加倍,以便有效渗透细胞膜。

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